Источник:
https://www.facebook.com/groups/oncolog/permalink/3272232569466839/Школа пациента. Методы определения наличия мутаций в генах BRCA.
Подготовила Тимовская Ю.А., к.м.н., врач онколог высшей категории, член ESMO.
Совместно с Шапочка Д.А., молекулярный генетик, заместитель директора по научной работе медицинской лаборатории «CSD».
Мы уже писали о наследственном РМЖ и РЯ, и опубликовали показания к определению мутаций в генах BRCA
https://www.facebook.com/stopbreastcancer.info/posts/130098065422724 . Сегодня мы поговорим о методах определения мутаций методами ПЦР и NGS.
Первым доступным для определения наличия мутаций в генах ассоциированных с РМЖ был тест BRACAnalysisR, минимальная стоимость которого составляла 4 тысячи долларов США. Метод был основан на секвенировании по Сэнгеру и включал в себя исследование всей кодирующей последовательности генов BRCA 1/2 (мы писали о разных локусах в 13 и 17 хромосомах, в которых были выявлены эти гены
https://www.facebook.com/stopbreastcancer.info/posts/129205158845348. Одним из обоснований высокой стоимости исследования было наличие большого количества локусов, обязательных для тестирования). Альтернативных вариантов не было, так как компания имела все патенты, на проведение всех исследований в этой области. Только в 2010 году действие патентов, запрещающих другим компаниям разрабатывать и внедрять методы тестирования на наличие мутаций в генах BRCA, было остановлено судом. После этого, для определения мутаций начали применять два метода – бюджетный метод, с ограниченным применением, аллель специфичный ПЦР и метод секвенирования «нового поколения» (англ. next generation sequencing – NGS).
Первый метод, аллель специфичная ПЦР (полимеразно цепной реакции), направлен на выявление наиболее распространенных мутаций в определенной популяции (О том, как определяли частоту определенных мутаций в популяции мы писали
https://www.facebook.com/stopbreastcancer.info/posts/129205158845348 ). Проверяют этим методом от 4 до 8 локусов, в которых могут присутствовать мутации. Метод бюджетный по стоимости и быстрый по времени. Но, в связи с небольшим количеством тестируемых локусов, метод ПЦР не всегда информативный. В тех случаях, когда мутация у пациентки имеется в том локусе, который попал в панель тестирования, эта мутация будет выявлена. С какой частотой локус с мутацией может быть обнаружен при тестировании методом ПЦР? Вероятность выявления мутаций методом ПЦР не высокая. Спектр мутаций в генах BRCA 1/2 огромный, описано более 1800 локусов мутаций для гена BRCA 1 (
https://arup.utah.edu/database/ BRCA/Home/BRCA1_landing.php) и более 2100 для BRCA 2 (
https://arup.utah.edu/database/BRCA/ Home/BRCA2_landing.php). 94,5% этих мутаций являются патогенными. Все эти мутации определяются в популяции с разной частотой. К наиболее часто встречаемым относятся две мутации в гене BRCA1 (185delAG и 5182insC) и одна в гене BRCA2 (6174delT). Эти мутации были определены одними из первых, и вначале составляли до 90% всех выявленных мутаций в генах BRCA, ассоциированных с наследственным РМЖ. Именно эти мутации определяют методом ПЦР (и еще несколько, часто встречаемы в РФ мутаций). Но в процессе детального изучения проблемы и накопления данных о мутациях, уже в 2000-х частота этих мутаций, среди всех случаев носительства наследственных мутаций в генах BRCA, снизилась с 90% до 20-30%. На данный момент времени методом ПЦР только у 15% пациентов можно определить мутации в генах BRCA.
Поэтому применение метода ПЦР с целью скрининга у всех пациентов, которым показано тестирование, не совсем оправдано. Преимуществом метода ПЦР является цена и скорость выполнения. Если пациент соответствует критериям необходимого тестирования на наличие мутаций в генах BRCA, первым этапом можно определить наличие наиболее частых вариантов мутаций методом ПЦР (метод точен, лимитирует только количество исследуемых локусов). Если мутация выявлена, предпринимать действия, согласно ситуации (определение или изменение тактики лечение РМЖ или РЯ, разработка индивидуального плана профилактики). Если мутация не выявлена, но пациент соответствует критериям NCCN для определения мутаций, рекомендовано проведение повторного исследования методом NGS (англ. next generation sequencing – NGS секвенирования «нового поколения»).
Второй метод NGS позволяет определить последовательно большое количество локусов в генах, где могут присутствовать мутации. Для РМЖ используется таргетная панель из 30 наиболее часто встречаемых и значимых мутаций в генах, нарушения в работе которых ассоциируются с высоким риском развития РМЖ и РЯ. Эффективность метода в 5 раз выше эффективности ПЦР. Кроме этого, NGC кроме мутаций в генах BRCA позволяет выявить другие мутации, такие как CHEK2, MSH6, PALB2 и NBN1. Метод секвенирования сложный в выполнении, нуждается в подготовке библиотек, непосредственно секвенировании и анализе полученных данных. Подготовка библиотек – это фрагментация ДНК и отбор целевых фрагментов для дальнейшего секвенирования с целью определения нуклеотидной последовательности ДНК и РНК с целью получения формального описания её первичной структуры. Технология методов секвенирования нового поколения позволяет «прочитать» единовременно сразу несколько участков генома, и выявить целевые мутации в заявленных фрагментах.
Для обоих методов определения наличия мутаций в генах BRCA необходим забор крови. Особых условий забора (натощак, возраст, день менструального цикла и других) нет. Срок выполнения анализов разный, это необходимо учитывать, чтобы не затягивать начало лечения. Для ПЦР – это несколько дней, для NGS – несколько недель, до месяца (в зависимости, где расположена лаборатория и как быстро будет доставлен материал). Стоимость тоже отличается, метод секвенирования дороже ПЦР. Лаборатории, в которых проводят исследование на наличие мутаций в генах BRCA, находятся во всех городах. Провести анализ методом NGS можно только в больших исследовательских центрах и высокоспециализированных лабораториях.
В идеале, все пациенты из группы высокого риска развития РМЖ должны иметь информацию о наличии мутаций в генах BRCA. Для этого должны быть внедрены скрининговые исследования на наличие этих мутаций у здоровых людей из групп высокого риска развития РМЖ, РЯ и других онкологических заболеваний. Это дало бы возможность разработать для всех индивидуальную программу профилактики, провести информирование по снижению индивидуальных рисков развития онкопатологии, а в случае возникновения опухоли – не затягивать с началом лечения. Но на сегодняшний день, секвенирование не соответсвует критериям метода, который можно использовать для скрининга (о критериях, которым должны соответсвовать методы, которые используют для скрининга, мы писали в посте о навигации диагностического пути
https://www.facebook.com/stopbreastcancer.info/posts/124843805948150). Поэтому всем пациентам провести анализ на наличие мутаций в генах, ассоциированных с повышенным риском развития РМЖ мы не можем. В недалёком будущем технологии секвенирования станут более быстрыми и менее дорогими, что позволит использовать их как метод скрининга для выявления мутаций в генах у здоровых и для идентификации мишеней для лекарственной терапии большинства онкологических больных.
Оставайтесь с нами.
Впереди нас ждет много интересного. В следующих публикациях мы продолжим тему семейного и наследственного РМЖ.
